ISOLASI
DAN KARAKTERISASI ENZIM α-AMILASE DARI KECAMBAH KACANG HIJAU
Neli Oktalia
Lab.
Agroindustri dan Tanaman Obat Prodi. Kimia Fakultas Sains dan Teknologi,
Universitas Jambi
ABSTRAK
Kacang hijau merupakan tanaman yang
banyak dimanfaatkan sebagai bahan pangan karena kandungan protein dan
karbohidratnya yang sangat tinggi. Protein dan karbohidrat juga diperlukan oleh
biji dalam proses perkecambahannya. Saat berkecambah, karbohidrat dalam biji
dalam bentuk amilum diurai menjadi senyawa yang lebih sederhana oleh enzim
α-amilase.Enzim α-amilase diisolasi dan dikarakterisasi dari kecambah hijau
dengan metode FUWA, pada kecambah hijau sebagai perbandingan untuk menentukan
jumlah enzim α-amilasenya divariasikan tempat pertumbuhan yaitu pada tempat
gelap terang dan lama usia pertumbuhan, adapun aktivitas enzim didapat paling
tinggi pada hari 1-3 terjadi penurunan pada hari ke 5-7 pengukuran berupa
absorbansi yang diukur dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis.
ABSTRACT
Green beans
is a plant widely used as food for protein and carbohydrate content is very
high. Protein and carbohydrates are also required by the seed germination
process. When germinate, carbohydrates in grains in the form of starch is
broken down into simpler compounds by the enzyme α-α-amylase amilase.Enzim
isolated and characterized from green sprouts with FUWA method, the green
sprouts as a comparison for determining the amount of the enzyme α-amilase
varied where growth ie on a bright and long dark age of growth, while the
highest enzyme activity obtained on day 1-3 decline on days 5-7 of measurement
such as absorbance was measured using a UV-Vis spectrophotometer.
PENDAHULUAN
Enzim adalah
substansi yang dihasilkan oleh sel-sel hidup dan berperan sebagai katalisator
pada reaksi kimia yang berlangsung dalam organisme, katalisator adalah
substansi yang dapat mempercepat reaksi suatu senyawa. Kemampuan enzim yang
unik dalam melaksanakan transformasi kimia yang khas dapat meningkatkan
penggunaan enzim dalam berbagai proses industri, salah satu enzim yang sangat
dibutuhkan dalam industri adalah amilase (α-amilase, β-amilase, dan ɣ-amilase
atau glukoamilase)(Sianturi,2008).
Enzim amilase
memiliki aplikasi untuk skala yang sangat luas mulai dari industry tekstil,
konversi pati untuk gula sirup,produksi cyclodextrins untuk industri farmasi (Suarni,2007).
Kebutuhan amilase didunia industri sangat tingggi, pada tahun 2004 saja sudah
mencapai penjualan sekitar US 2 milyar, sedangkan amylase yang digunakan untuk
industry makanan dan minuman pada tahun 2004 bernilai sekitar US 11 juta dollar
(Sivaramakrishnan dkk,2006) seiring dengan meningkatnya penggunaaan enzim amilase,
maka perlu dicari sumber enzim amylase dari bahan baku yang mudah didapatkan.
Salah satu bahan yang memiliki potensi untuk dieksplorasi sebagai sumber enzim
amilase adalah tumbuhan kacang-kacangan.
Sumber dari amilase
yang cukup kaya adalah kecambah kacang-kacangan. Kecambah kacang-kacangan memiliki
kandungan enzim amilase yang tinggi dibanding kondisi biji utuh ataupun
tumbuhan dewasa, pada proses perkecambahan dangan makanan dalam biji-bijian
diubah untuk membentuk struktur akar,batang daun(tunas). Perkecambahan
merupakan proses pertumbuhan dan perkembangan embrio. Hasil perkecambahan ini
adalah munculnya tumbuhan kecil dari biji dimana plamula tumbuh dan berkembang
menjadi batang, dan radikula tumbuh dan berkembang menjadi akar.Perkecambahan
dimulai dengan proses penyerapan air kedalam sel-sel pada biji. Masuknya air
kedalam biji menyebabkan enzim aktif
bekerja. Enzim amilase bekerja memecah tapung menjadi maltose, selanjutnya maltose
dihidrolis oleh maltase menjadi glukosa. Protein juga di pecah menjadi
asam-asam amino. Pada kecambah dari kacang hijau ini
mudah penanamannya dan juga lebih mudah dilakukan isolasi dan karakterisasi
pada beberapa variasi penanaman kecambah kacang(anonim).
BAHAN DAN METODE
Penelitian ini
dilakukan mulai pada tanggal 28 September 2016 hingga tanggal 9 November 2016.
Sampel diambil dari beberapa variasi penanaman kecambah yaitu tempat gelap dan terang
serta lamanya hari penanaman. Selanjutnya dilakukanisolasi dan karakterisasi
dilaboratorium.
Bahan
Penelitian
Bahan utama yang
digunakan pada penelitian ini adalah kecambah kacang hijau yang ditanam dengan
variasi tempat gelap terang dan lamanya hari penanaman kecambah,Larutan
Na-asetat 0,2 M, HCl 1 M, KI/I2 , aquades.
Alat
Penelitian
Peralatan utama yang
digunakan adalah PH meter, Timbangan, Pinset, Gelas ukur 100 ml,10 ml,25 ml,
Gelas kimia, Mortar, Erlenmeyer, alat sentrifugasi, inkubator,thermometer,Spektrofotometer
UV-Vis.
PROSEDUR
KERJA
Penumbuhan
kacang hijau
Biji
kacang hijau disortasi hingga diperoleh biji bersih dan utuh, dicuci, direndam
dengan aquades selama 30 menit, ditiriskan, kemudian diperam dalam wadah
berpori sampai terjadi perkecambahan (1, 2, 3, 4 dan 5 hari).
Pembuatan
ekstrak enzim dari kecambah kacang hijau
Kecambah
dibersihkan dengan melepas kulit luarnya, sebagian sampel untuk analisis kadar
protein dan air. Sebagaian ditimbang kemudian dihancurkan dengan blender,
dimana untuk 1 g kecambah ditambahkan 5 mL buffer asetat 0,2 M pH 5.
Kecambah yang sudah hancur disimpan selama 10 menit sambil sekali-sekali
dikocok kemudian dilakukan pnyaringan dengan kapas. Filtart yang dihasilkan
disentrifugasi selama 20 menit dengan kecepatan 2000 rpm pada suhu 5oC.
Selanjutnya dimasukkan ke inkubator untuk kemudian dibuat kurva kalibrasi dan
penentuan aktivitas enzim.
Pembuatan
Kurva kalibrasi
Dibuat konsentrasi
0,1 %, 0,2%, 0,3%, 0,4% , 0,5%, 0,6%, 0,7%, dan 0,9%, kemudian ditambahkan 200
mikroliter HCl 1M, 200 μL KI/I2 dan 3,4 dd H2O kedalam
200 μL pati terlarut. Kemudian diukur absorbansi pada panjang gelombang 600 nm.
Penentuan
aktivitas enzim amilase
Disiapkan 200 μL pati
terlarut 0,5 % kemudian ditambahkan 200 μL enzim α-amilase. Diinkubasi pada T
30OC selama 10 menit. Ditambahkan 200 μL HCl 1M, 200 μL, KI/I2
dan 3,4 dd H2O, kemudian diukur absorbansinya dengan panjang
gelombang 600 nm.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Kecambah biji kacang hijau memiliki enzim amilase (enzim ini akan aktif
setelah terjadi proses imbibisi atau penyerapan air). Enzim ini dibutuhkan
untuk menghidrolisis pati menjadi maltosa, kemudian maltosa dihidrolisis oleh
enzim maltase menjadi glukosa. Proses katabolisme ini ditujukan untuk
pertumbuhan kecambah.
Pertumbuhan suatu kecambah atau tanaman memiliki beberapa faktor
diantaranya yaitu tempat tumbuh dan lamanya penumbuhan.Berdasarkan
tempat tumbuh yaitu tempat terang dan gelap dipengaruhi oleh fitohormon, terutama hormon auksin. Fungsi utama hormon
auksin adalah sebagai pengatur pembesaran sel dan memacu pemanjangan sel di
daerah belakang meristem ujung. Hormon auksin ini sangat peka terhadap cahaya
matahari. Bila terkena cahaya matahari, hormon ini akan terurai dan rusak. Pada
keadaan yang gelap, hormon auksin ini tidak terurai sehingga akan terus memacu
pemanjangan batang. Akibatnya, batang tanaman akan lebih panjang jika ditanam
di tempat yang gelap, tetapi dengan kondisi fisik tanaman yang kurang sehat,
akar yang banyak dan lebat, warna batang dan daun pucat serta kekurangan
klorofil sementara ditempat
terang kecambah memiliki warna segar dan memiliki daun berwarna hijau dan
lamanya waktu mempengaruhi perkembangan kecambah yaitu semakin lama waktu
pertumbuhan semakin tinggi kecambah. Berikut ini hasil dari pertumbuhan
kecambah usia 5 hari :
Tempat
gelap
Tempat terang
Tabel
1.
Pembuatan ekstrak enzim dari kecambah kacang hijau(tempat terang)
|
Perlakuan
|
Hasil
|
|
Digerus kecambah kacang hijau
Ditimbang 3 gr + 15 mL buffer asetat
0,2 mL (didiamkan 10 menit)
-Disaring
-Disentrifugasi 2000 rpm suhu 5oC
|
5 mL supernatant
ekstrak enzim
|
Tabel
2.
Pembuatan ekstrak enzim dari kecambah kacang hijau(tempat gelap)
|
Perlakuan
|
Hasil
|
|
Digerus kecambah kacang hijau
Ditimbang 3 gr + 15 mL buffer asetat
0,2 mL (didiamkan 10 menit)
-Disaring
-Disentrifugasi 2000 rpm suhu 5oC
|
5 mL supernatant
ekstrak enzim
|
Ekstraksi
enzim amilase dari kecambah yang telah ditanam dihancurkan dengan menggunakan
alat mortar untuk mengeluarkan enzim amilase yang merupakan endoselluler.
Kemudian ditimbang sebanyak 3 gr dengan timbangan analitik lalu dimasukkan ke
dalam erlenmeyer. Kemudian ditambahkan larutan buffer asetat untuk menstabilkan
pH agar netral karena enzim tidak dapat bertahan pada pH yang terlalu tinggi
ataupun terlalu rendah. Lalu didiamkan selama 10 menit dan sesekali diaduk. Hal
tersebut bertujuan untuk mengoptimalkan pada saat ekstraksi enzim. Kemudian
disaring dengan kertas saring whatman untuk memisahkan ampas dengan filtrat.
Kemudian didapat 5 ml filtrat selanjutnya disentrifugasi. Sentrifugasi
dilakukan pada kecepatan 2000 rpm Sehingga hasil akhirnya berupa supernatan
yang berada di atas permukaan dan terdapat endapan yang disebut pellet.
Penentuan aktivitas enzim α-amilase dengan metode Fuwa
adalah berdasarkan reaksi antara amilosa dengan iodin yang menghasilkan
kompleks heliks dan memberikan warna biru yang khas, sehingga dapat diketahui
besar absorbansi pada Spektrofotometer UV-Vis dengan panjang gelombang 600 nm,
dimana besar penyerapan pada tempat terang absorbansi lebih besar hal ini
disebabkan aktivitas enzim yang terdapat pada pertumbuhan tempat terang banyak
dibandingkan tempat gelap karena kadar pati yang terkandung pada tempat gelap
lebih besar akibat adanya proses fotosintesis sementara pada tempat gelap tidak
terjadi proses fotosintesis yang baik.
Tabel
4.
Pembuatan Kurva kalibrasi
|
Konsentrasi (%)
|
Panjang gelombang (nm)
|
absorbansi(A)
|
|
0,1
|
600 nm
|
0,313
|
|
0,2
|
600 nm
|
0,622
|
|
0,3
|
600 nm
|
0,735
|
|
0,4
|
600 nm
|
0,759
|
|
0,5
|
600 nm
|
0,757
|
|
0,6
|
600 nm
|
0,760
|
|
0,7
|
600 nm
|
0,761
|
|
0,9
|
600 nm
|
0,763
|
Bedasarkan tabel kurva kalibrasi yang
didapat kurva kalibrasi sebagai berikut yaitu
Pada kurva kalibrasi dari konsentrasi
0,1%-0,7% dan 0,9% tingkat absorbansinya semakin meningkat, pembuatan kurva
kalibrasi ini digunakan untuk mengetahui absorbansi optimum dari variasi
persentase larutan sehingga pada kondisi optimumnya digunakan untuk pengukuran
enzim amilase pada variasi tempat dan waktu penanaman kecambah.
Tabel
5.
Pengukuran absorbansi sampel enzim α-amilase pada kecambah kacang hijau
|
Perlakuan
|
l
nm
|
A
|
Ket
|
|
Terang
Gelap
|
600
|
0,728
0,686
|
1 hari
|
|
Terang
Gelap
|
600
|
0,396
0,255
|
3 hari
|
|
Terang
-
Dengan daun
-
Tanpa daun
Gelap
|
600
|
0,701
0,548
0,359
|
5 hari
|
|
Terang
-
Dengan daun
-
Tanpa daun
Gelap
|
600
|
0,744
0,763
0,489
|
7 hari
|
Bedasarkan tabel
diatas dapat dianalisis data dari kandungan enzim amilase dari sampel 1 hari, 3
hari, 5 hari dan 7 hari terjadi perbedaan hasil yang cukup signifikan, pada
hari ketiga seharusnya hasil yang didapat pertumbuhan dari 1 hari sampai hari
ke-3 meningkat kemudian menurun pada usia perkecambahan hari ke-5.
Ketidaksesuaian dari data ini desebabkan karena pengerjaan 1 hari, 3 hari, 5
hari dan 7 hari tidak ditempat yang sama dan juga kadar air yang digunakan juga
berbeda sementara itu aktivitas enzimatis sangat dipengaruhi oleh air karena
air dapat mengaktifkan reaksi metabolisme pada kecambah. Peningkatan kadar air
pada kecambah meningkatkan reaksi enzim amilase untuk memecah amilum dengan
adanya air maka substrat lebih mudah berdifusi menuju enzim, sehingga kecepatan
reaksi hidrolisis lebih cepat. Sehingga didapatlah data yang kurang bersesuaian
saat pengukuran absorbansi dengan spektrofometer uv-vis pada hari ke-3
sementara absorbansi yang paling besar yaitu pada hari ke-7.
Sebagai perbandingan
untuk menentukan hasil absorbansi secara tepat dilakukan pengulangan percobaan
dengan waktu, perlakuan, bahan yang sama didapat data sebagai berikut :
|
Perlakuan
|
l
nm
|
A
|
Ket
|
|
Terang
Gelap
|
600
|
|
1 hari
|
|
Terang
Gelap
|
600
|
0,755
0,749
|
3 hari
|
|
Terang
-
Dengan daun
-
Tanpa daun
Gelap
|
600
|
0,716
0,599
0,497
|
5 hari
|
|
Terang
-
Dengan daun
-
Tanpa daun
Gelap
|
600
|
0,540
0,775
0.667
|
7 hari
|
Dari tabel data
pengulangan perlakuan tersebut didapat data yang berubah signifikan dimana pada
data ini dari hasil absorbansi dari hari ke-1 sampai hari ke-3 meningkat dan
terjadi penurunan pada hari ke-5 dan ke-7 hal ini terjadi karena aktivitas
enzim α-amilase pada usia ke 5 dan ke-7 telah berkurang sementara pada usia 1-3
merupakan kondisi optimum kecambah menghasilkan enzim α-amilase.Sementara pada
tempat gelap enzim amilase yang dihasilkan kurang maksimal karena tidak terjadi
proses fotosintesis dan yang berperan besar dalam pertumbuhan perkecambahan
yaitu hormon giberelinnya sementara enzim amylase pada tempat gelap tidak
terlalu berperan sehingga data yang didapatkan tidak konstan.
KESIMPULAN
Berdasarkan
penelitian yang didapat dapat disimpulkan bahwa kecambah kacang hijau
menghasilkan enzim α-amilase banyaknya kandungan enzim dipengaruhi oleh usia
dari kecambah dan juga lingkungan dari pertumbuhan kecambah yaitu tempat gelap
dan terang, enzim α-amilase kecambah optimal pada usia 1-3 hari dan terjadi
penurunan pada usia 5 hari, dan juga optimal pada kondisi terang karena pati
pada kecambah akan terjadi proses fotosintesis sehingga jumlah enzim amilase
yang didapat juga lebih besar.
DAFTAR
PUSTAKA
Sivaramakrishnan, S., Gangadharan, D.,
Nampoothiri,K.M., Soccol,C.R., and Pandey,A., 2006, α-amilase from Microbial sources,Food technol, Bioethanol,44(2):
173-184.
Sianturi, D.C., 2008,Isolasi Bakteri dan Uji aktivitas enzim amilasetermofil kasar dari sumber air panas panen sibirubiru
Sumatera Utara, Tesis diterbitkan, Sekolah pasca sarjana Sumatera Utara,
Medan.
Suarni dan patong,R., 2007, Potensi kecambah
kacang hijau sebagai sumber enzim amylase,
Indo J.Chem.,2007,7(3);332-336.
Publikasi : 9-11-2016
Semoga bermanfaat^^
